一、基本原理

抗原-抗體特異性結合

利用抗原與抗體的高親和力結合特性，形成穩定復合物（如病毒蛋白與特異性IgG抗體）。

酶標記信號放大：酶（如HRP、AP）標記抗體或抗原，催化底物顯色（如TMB顯藍色），吸光度與目標物濃度成正比。

定量依據：比爾-朗伯定律（A=εcl），通過酶標儀測定450 nm吸光度（OD值）計算濃度。

核心試劑

固相載體：聚苯乙烯微孔板（吸附抗體/抗原）。

標記物：酶標抗體（如HRP-抗人IgG）、酶標抗原。

底物：TMB（HRP常用）、pNPP（AP常用）。

二、實驗步驟

包被（Coating）

將捕獲抗體/抗原用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋后加入微孔板，4℃過夜或37℃孵育2小時，形成固相層。

關鍵點：包被后需倒液避免甩板，防止抗體脫落。

封閉（Blocking）

加入封閉液（5%脫脂奶粉或1% BSA的PBS），覆蓋未結合位點，減少非特異性吸附，37℃孵育1-2小時。

注意：封閉劑需覆蓋孔底，避免邊緣干涸。

加樣與孵育

待測樣本按梯度稀釋后加入孔中，37℃孵育1-2小時。需設置復孔以減少誤差。

樣本處理：血清需離心去除顆粒物，細胞培養上清需過濾除菌。

酶標二抗孵育

加入HRP標記的二抗（如抗人IgG-HRP），室溫避光孵育1小時。二抗需離心去除沉淀。

顯色與終止

加入TMB底物溶液，避光反應10-30分鐘至陽性孔顯藍色。終止液（2M H?SO?）終止反應，顏色轉為黃色。

注意：終止后30分鐘內完成檢測，避免吸光度漂移。

結果讀取

使用酶標儀測定450 nm吸光度，繪制標準曲線（常用四參數邏輯回歸），計算樣本濃度。

三、實驗方法類型

雙抗體夾心法

應用：檢測大分子抗原（如病毒蛋白、細胞因子），靈敏度高（pg級）。

案例：檢測HBsAg時，靈敏度達0.1 ng/mL。

間接法

應用：檢測抗體（如HIV抗體、疫苗效價評估），靈活性強。

案例：血液篩查中檢測HIV抗體，窗口期后準確率＞99%。

競爭法

應用：檢測小分子半抗原（如農藥殘留、激素），適合復雜基質。

案例：檢測黃曲霉毒素B1時，線性范圍0.25-5.0 ng/mL。

捕獲法

應用：檢測IgM抗體（如麻疹病毒IgM），避免IgG干擾。

四、關鍵注意事項

操作規范

加樣需精準（微量移液器校準），避免孔壁殘留或交叉污染。

洗滌干凈（5次PBST洗滌），減少背景干擾。

試劑與儀器

標準品需分裝凍存，避免反復凍融導致降解。

酶標儀需定期校準，確保波長準確性（如450 nm±2 nm）。

常見問題與解決

高背景：封閉不足→延長封閉時間；洗滌不干凈→增加洗滌次數。

信號弱：抗體失活→驗證活性；孵育溫度不足→延長至4℃過夜。

假陽性：類風濕因子干擾→樣本稀釋或使用特異性更高的抗體。

五、應用領域

臨床診斷

傳染病檢測：HIV抗體、乙肝表面抗原（HBsAg）、登革熱IgM抗體。

腫瘤標志物：AFP、CEA檢測，輔助癌癥早期篩查。

食品安全

農藥殘留：三唑酮、百菌清檢測，靈敏度達ng/g級。

毒素檢測：黃曲霉毒素、赭曲霉毒素B1定量分析。

藥物研發

藥效評估：細胞因子（如IL-6、TNF-α）濃度監測。

疫苗開發：抗體效價測定。

六、實驗常見問題

問題現象          可能原因                                            解決方法

空白背景高       洗板不干凈、顯色液變質                    延長洗板時間，更換顯色液2

信號弱或無信號抗體失活、孵育溫度不足                   驗證抗體活性，延長孵育時間2

假陽性               類風濕因子干擾、交叉反應              使用F(ab')片段標記抗體5

重復性差           加樣量不一致、溫控不穩定               校準移液器，控制恒溫箱溫度2

七、技術進展

第四代HIV試劑盒

結合抗體與p24抗原檢測，窗口期縮短至2周。

化學發光ELISA

采用魯米諾或吖啶酯標記，靈敏度提升至fg級。

微流控芯片ELISA

集成樣本處理、反應、檢測于一體，實現POCT（即時檢測）。

自動化系統

全自動酶標儀支持高通量檢測（如96孔板批量處理），減少人為誤差。

八、總結

ELISA憑借其高靈敏度、特異性和操作便捷性，成為生物醫學研究及工業檢測的核心技術。實驗成功的關鍵在于嚴格把控操作細節（如封閉、洗滌）、合理選擇方法類型（如夾心法檢測抗原）以及定期維護儀器（如酶標儀校準）。未來隨著微流控、化學發光等技術的融合，ELISA將在快速診斷和現場檢測領域發揮更大作用。